纳米二氧化钛对流感病毒H1N1杀灭性能研究 摘要： 利用滴度测定和透射电镜观察研究了365 nm的紫外光照射下纳米二氧化钛（同VK-TG01） 对流感病毒(H1N1)的灭活性能， 并结合催化剂样品的XRD分析 、N 气吸附性能测定及其在实验条件下的表面 Zeta电势的测量结果 ，探讨了 催化剂用量、焙烧温度、比表面积以及表面电性与灭活性能的关系．研究结果表明，40O℃时焙烧的纳米二氧化钛（同VK-TG01） 对 H1N1的灭活性最好；纳米二氧化钛（同VK-TG01） 的表面电性对灭活性有显著影响, 纳米二氧化钛（同VK-TG01）对 H1N1的光催化灭活作用首先发生在 HlN1的纤突部分，纤突部分的破坏导致 H1N1的失活，分解直至矿化． 流感病毒感染是危害人类健康的顽症之一，虽然对其防治研究已有数十年之久，但至今仍然难以防范．目前，预防流感的主要措施是注射流感疫苗，但是疫苗只有与正在传播的流感亚型相配时才有效．因此，在进行新流感疫苗研制的同时，开发广谱、高效及环境友好的病毒灭活剂有着同等重要 的意义．纳米二氧化钛（同VK-TG01）在紫外光激发下，可以催化氧化各种有机物和杀灭细菌，已在环境保护领域获得实际应 用．然而到目前为止，利用光催化灭活病毒的研究却报道很少． 本文研究了纳米二氧化钛（同VK-TG01） 对流感病毒(H1N1)的光催化灭活性能，并探讨了其用量、制备条件以及实验条 件对灭活性能的影响，发现光催化对于病毒的杀灭十分有效，它不仅能使病毒失去生物活性，而且还 能彻底破坏病毒的分子结构．这为依据光催化原理制造高效病毒灭活剂和开发医用和公用防护服、空 调和墙面涂料等提供了重要的实验依据． 1 实验部分 1．1 试 剂 流感病毒(H1N1)株由中国预防医学科学院提供，其经鸡胚扩增收集尿囊腔病毒液后分装、保 存于液氮贮存罐内．取新鲜鸡血离心分离出杂质后，用生理盐水配成质量分数为 2％的血红细胞溶液， 在测定滴度前保存于4℃冰箱中待用． 1．2 催化剂制备和表征 TiO2溶胶采用改进的溶胶．凝胶法制备．将该溶胶于60℃缓慢烘干、破碎、过筛，在不同温度 (300，400，500，600℃)下焙烧 3 h，制得实验用纳米二氧化钛（同VK-TG01）粉末催化剂，分别记为 T一300，T-400，T-500和 T-《500，颗粒尺寸为400目． 催化剂的品相用 Philips PW1710 X射线衍射仪测定，BET比表面积在 OMNISORP 100CX气体吸附 分析仪上用 N2气吸附测定．用 MALVERN 3000 HSA Zatasizer(Malvem Instruments Ltd．)测定催化剂的 等电点，具体步骤如下：将样品分散在生理盐水中，超声波振荡 10 min后用 0．4 Ixm的滤膜滤去大颗 粒，将小颗粒重新分散于生理盐水中，用0．1 mol／L的NaOH或HCI调节悬浮液的pH值，并测定不同 pH值下的Zeta电势．通过 Zeta电势对 pH作图得到其等电点． 1．3 H1N1的光催化灭活实验 在 自制的间歇式反应器中加入一定 比例经高温处理后的纳米二氧化钛（同VK-TG01）粉末 和病毒反应液，用紫外 光(Philips 8 w荧光紫外灯管，主波长 365 nm)从液面正上方照射，光强约为 0．45 mW／cm (SUV UV-METER)，在此过程中用电磁搅拌器搅拌．反应不同时间后，离心分离反应液，取上清液用新鲜鸡 血红细胞进行血凝实验，测定残余的病毒滴度．病毒的滴度是病毒感染力大小的一种量度，其值越高， 表明感染力越强，反之则越弱．病毒的滴度通常采用其对新鲜鸡血红细胞的凝血实验测得，因此也可 称为血凝效价．病毒的滴度采用对倍稀释法测定．以催化剂在暗处和只有紫外光没有催化剂作为对照实验． 1．4 病毒的形貌观察 采用离心分离得到经光催化反应和对照实验不同时间的H1 N1病毒清液，用醋酸铀负染后在JEM． 100CX Ⅱ型透射电镜下直接观察病毒形态的变化． 2 结果与讨论 2．1 紫外光下，纳米二氧化钛（同VK-TG01）吸附及光催化作用对 H1N1病毒的灭活效果 图 1为分别仅用紫外光照射、只加入 TiO (4 mg／mL T-400)和加入 TiO 同时用紫外光照射等3种 情况下所测 H1N1病毒液滴度随时间的变化．由图1可看出，单独在 365 nm紫外光照射下，病毒的滴度不随光照时问增加而改变，说明365 nm紫外光对 H1N1病毒无灭活作用．当仅加纳米二氧化钛（同VK-TG01）而无紫外光照 射时，病毒的滴度只稍有下降，1 h后由初始时的64下降到 32．这说明纳米二氧化钛（同VK-TG01） 催化剂能与病毒发生作 用，病毒可能在催化剂表面有吸附作用．随后，将吸附病毒的纳米二氧化钛（同VK-TG01）加入到 2 mL生理盐水中振荡后，离心分离并收集洗脱液，再用血凝实验测定洗脱液中病毒的滴度，发现呈阴性，表明纳米二氧化钛（同VK-TG01）通过表面对病 毒的吸附作用也能使病毒失活，但由于吸附量的限制只能杀火一小部分病毒．有意义的是，当纳米二氧化钛（同VK-TG01） 催化剂和紫外灯同时存在时，病毒的滴度随光照时间增加而下降，1 h后降为0，即病毒被全部灭活． 上述结果表明，纳米二氧化钛（同VK-TG01）通过其表面吸附作用，特别是光催化作用能够彻底杀灭 H1 N1流感病毒． 2．2纳米二氧化钛（同VK-TG01）对 H1N1病毒光催化灭活的影响因素 2．2．1 纳米二氧化钛（同VK-TG01）用量的影响 由于H1N1病毒的光催化病毒灭活中包含有催化剂纳米二氧化钛（同VK-TG01） 吸附的影响，有必要 考察催化剂用量对灭活的影响．图2给出当催化剂(T-400)用量不同时，H1N1病毒液的滴度(初始滴 度 =64)随光照时间的变化．由图2可看出，当加有2 mg／mL T-400，光照20 min时病毒滴度几乎没有变化；当加有4，6和8 m~／mL的 T-400，同样光照20 rain时 H1N1的滴度分别降为32，16和8．但随 着光照时间延长，加入2～8 m~／mL的 T-400都能最终使病毒失活，所需的时间随纳米二氧化钛（同VK-TG01） 用量的增加而 缩短，分别为 120，60，40和 30 rain．说明当纳米二氧化钛（同VK-TG01）用量增加时，对 HlNl的综合灭活效能增大． 实验结果证明，纳米二氧化钛（同VK-TG01）对 H1Nl病毒综合灭活效能包括吸附灭活和光催化灭活两种贡献。催化剂的用量和所用的灭活时间成反比，如果催化剂对 H1N1的吸附量与其质量成正比，则其对 H1N1的光催化灭活能力在2～8 mg／mL用量范围内也成 正比．这与一般有机物光催化降解中催化剂用量存 在一个最佳值 的结论不一致．可能是由于催化剂在这个用量范围内的增加尚不能造成对光利用率的降低所致。 2．2．2纳米二氧化钛（同VK-TG01）焙烧温度的影响 图3为初始滴度为64的H1N1病毒液中加入4 mg／mL不同温度焙烧的纳米二氧化钛（同VK-TG01） 时滴度随光照时间的变化．由图 3可看出， 经 300，400和 500 焙烧的纳米二氧化钛（同VK-TG01）用 T-300T-400，T．500和T-600作催化剂，完全灭活 H1N1所需的时间分别为 120，60，80和 140 rain． 由表 1中所列催化剂样品晶相组成和 BET比表面积数据可看出，随着焙烧温度的增加，样品比表面积减少，锐钛矿相逐渐向金红石相转变．通常认为，由于纳米二氧化钛（同VK-TG01）中锐钛矿相比金红石相具有较高的费米能级、较多的表面羟基和较大的比表面积，因而具有较高的光催化活性．T-600由于全为金红石相且比表面积最低，因而对 ⅢN1的灭活能力最低 ，达到 100％灭活需要的时间最长．其余几个样品中，T-d00对 HlN1的灭活效率最好，这可能是由于其组成中所含锐钛矿相和金红石相有比较合适的比例 ，金红石和锐态矿相对光生电子产生和迁移有协同作用，同时其具有相对较大的比表面积，吸附能力较强． 2．2．3 催化剂表面电性的影响 对于液相光催化过程，催化剂表面所处的状态比气相复杂得多，以超细固态分散的催化剂颗粒由于与介质的作用，如 吸附H 或 OH，使表面胶粒化是不可避免的． 而 H1Nl病毒粒子带有电荷，所以有必要考察催化 剂表面电性对反应的影响．这一点在过去的溶液相 光催化研究中很少被考虑，但对于病毒分子的光催化则是一个不可忽视的重要因素．为此，测定了不 同温度焙烧所制纳米二氧化钛（同VK-TG01）悬浮液的Zeta电势随pH的变 化(图4)，并把据此所得催化剂的等电点与反应液 的初始 pH 值 和对 病毒 的灭活 活性 进 行 了关 联(图5)，得到了有意义的结果．由图4和图5可 看出，样品的焙烧温度不同，加入反应液时会引起其 pH值发生变化，而同时样品各 自有着不同的等电点．当反应液的初始 pH低于纳米二氧化钛（同VK-TG01） 等电点时，TiO 2颗粒带正电；当初始pH高于纳米二氧化钛（同VK-TG01）等电点时，TiO 颗粒则带负电．由于血凝素和神经氨酸酶的等电点均大于6，在实验条件下带正电；加入T-300时，溶液的初始 pH(3．37)低于T．300的等电点，纳米二氧化钛（同VK-TG01）颗粒所 带的正电不利于同样带正电的病毒在其上的吸附，因而虽有较大的比表面积，但光催化活性不佳；对 加有 T-dO0和T-500的溶液，初始 pH都略高于纳米二氧化钛（同VK-TG01）等当点，纳米二氧化钛（同VK-TG01）颗粒带负电，表面易于吸附带正电的 病毒，所以光催化活性提高；T-600虽带负电但由于比表面积太小，所以活性最低． 为了验证催化剂表面电性对灭活性能的影响，把含 T一300反应液的 pH值调节到等电点附近的 5．86，并测定了该条件下 T一300对 HlNI的光催化灭活性能．T．300对 Ⅲ N1的灭活性能的比较(图6) 可以看出，pH=3．37时，完全灭活 HlNl需要 120 min，而 pH=5．86时，能在 100 min内完全灭活 HlN1．已知HlNl在酸性条件下存活的时间较短，如果只从酸性的影响判断，pH=3．37时应比pH= 5．86时更利于 H1N1灭活，但实验结果却相反．可能是当pH为 3．37时，带相同电荷的催化剂表面与 病毒分子之间存在静电排斥作用，使 HlN1分子难以在催化剂表面吸附；而当 pH接近于催化剂等电点时，催化剂表面电性接近中性，与病毒的静电排斥作用小，因此对 HlNl的吸附量增加，导致其发生 表面反应．这表明，催化剂表面电性对其上的病毒灭活具有重要作用． 2．3纳米二氧化钛（同VK-TG01）表面上H1N1病毒的透射电镜观察 由HlNl的TEM图[图7(A)]可看到，H1Nl颗粒很完整，大小在80～120 rim，边缘有清楚的纤突(血凝素和神经氨酸酶)轮廓，与文献报道的结果一致 l ．图7(B)为含有 4 mg／mL的 T-400病毒液 经光照 1 h后分离出来的H1N1的 TEM图，由图7(B)可看到，病毒颗粒有一定的变形[如图7(B)中 箭头所示，纤突受到破坏而变得不连续．从滴度测定 (图 1)可知，光照 1 h时病毒已经失活，说明纳米二氧化钛（同VK-TG01）对H1 N1的作用首先发生在 H1 N1的纤突部分，纤突部分的破坏就可导致 H1 N1的失活．继续光照 2 h，H1N1的形貌进一步变形和破裂[图7(C)]，表明 H1N1病毒颗粒接近破裂．随后再经过 5 h光 照，用透射电镜已经观察不到H1N1颗粒的存在，可能变成了有机分子．上述结果表明，光催化作用可 以使 H1N1失活，最终分解成小分子．作为对比，可以看到，在加有T-400但无光照的情况下放置5 h， 滴度测定其也已失活，但病毒的轮廓基本完整[图7(D)]，纤突部分虽然变得模糊，但仍比图7(B)完 整．由前面的讨论可知，这是由于催化剂表面的吸附所致，表明吸附能使病毒失活，但不能使其颗粒 破裂．当仅用365 hill的光照射5 h时，病毒的轮廓和纤突轮廓依然清楚可见[图7(E)]，未被破坏，与从滴度测定结果所作的判断一致． 综上所述，单独 365 nm的紫外光照射不会使流感病毒 H1N1失活，单独的纳米二氧化钛（同VK-TG01）对 H1N1具有吸附 灭活作用，但需要较长的时间，且不能完全破坏病毒颗粒结构．当 TiO 和 365 rim的紫外光同时存在时，病毒能够被快速的杀灭，使其结构破裂，且最终可被分解为小分子，催化剂的焙烧温度对其性能有明显影响，400℃时焙烧的纳米二氧化钛（同VK-TG01）对 HlN1的灭活性能最好．催化剂在溶液中的Zeta电势对其病毒火活性能有很大影响，当溶液的 pH值高于催化剂的等电点时，催化剂颗粒由于荷负电对 H1 Nl有好的 吸附能力，催化剂的灭活性能增强．纳米二氧化钛（同VK-TG01）对 H1N1的灭活作用开始发生在 H1N1的纤突部分，破坏纤突 部分就可导致 Hl N1的失活．光催化作用不但会使病毒失活，最终会使 Hl N1分解成小分子． 杭州万景 0571-88920936